吴镇宇出身于第11期无线电视艺员训练班（1982年），并成为该台男艺员，当年同期毕业的还有梁朝伟、周星驰、李子雄、欧阳震华等人。在出道首几年，他都只是于无线电视的连续剧里担任跑龙套的小角色。直到1980年代中开始，演出才开始增多。自1985年开始，吴镇宇经常参演大量无线剧集，以饰演反派角色为主，如《生命之旅》的杜朗贤，《盖世豪侠》的段玉楼更是其中的代表作。后来他逐步脱离反派角色的定型。1992年结束了与无线的8年合约，吴镇宇决定彻底投身电影圈。吴镇宇是于1986年凭演出《靓妹仔3之午夜丽人》而进入电影圈。在电影圈早期，吴镇宇几乎都只能出演一些小角色。1992年饰演《绝代双骄》的头号反角江玉郎。1993年客串周星驰的《唐伯虎点秋香》中的四大才子之一文征明。1996年吴镇宇参演了由郑伊健、陈小春主演的《古惑仔之人在江湖》，他打破常规性的黑社会凶神恶煞的套演方式，把一个心理极度疯狂歇斯底里神经质的形象融合到这个反派身上。1997年出演《难兄难弟》饰演老实、敦厚的谢源老实、敦厚。1997年先后与刘青云拍挡，主演了杜琪峰导演的《一个字头的诞生》以及电影《高度戒备》。并且《一个字头的诞生》这部电影，获得了1998年电影金紫荆奖最佳男配角奖。
1998年与吴君如、方中信等合作电视剧《古惑仔》，饰演黑帮角色靓坤。1998年执导自己的第一部作品《9413》。1999年主演叶伟信导演的《爆裂刑警》。同年主演杜琪峰导演的《枪火》。2000年凭借《公元2000》里一个出场了10分钟的在客串演员表的配角，他拿下了当年香港金像奖的最佳男配角奖和金紫荆奖最佳男配角奖。同年继续跟叶伟信导演合作，和吴君如主演了《朱丽叶与梁山伯》。2001年在第七届香港电影评论学会大奖颁奖礼上获得最佳男演员奖。2002年吴镇宇凭借《朱丽叶与梁山伯》获第二十届香港电影金像奖最佳主角提名。2003年重回无线，接拍台庆剧《冲上云霄》。2003年吴镇宇凭借《无间道Ⅱ》倪永孝的角色，被第二十三届香港电影金像奖最佳男主角提名。2005年的《神经侠侣》里饰演善良、固执但没有攻击性的精神病患者。
2006年主演电影《卧虎》，饰演一个个性冲动，嗜血残暴的黑道反派角色，并凭此角色获得第43届金马奖最佳男主角提名。2010年出演的电影《西风烈》中吴镇宇饰演杀手。2012年3月1日《疯狂的蠢贼》首映，吴镇宇亲赴北京四家影院宣传造势。2012年与周润发合作，出演《大上海》中茅载一角。2014年主演的电影《京城81号》中分饰两角。同年吴镇宇携子参加湖南卫视综艺节目《爸爸去哪儿2》。节目开播后，吴镇宇一直占据“人气爸排行榜”第一的位置。2016年5月6日，主演的电影《判我有罪》上映。
